洋蔥伯克霍爾德菌群檢查法草案公示稿

  洋蔥伯克霍爾德菌群檢查法系用于在規定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在洋蔥伯克霍爾德菌群（Burkholderia cepaciacomplex，Bcc）。

  當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否含有洋蔥伯克霍爾德菌群時，應按下列規定進行檢驗，包括樣品取樣量和結果判斷等。

  供試品檢出洋蔥伯克霍爾德菌群或其他致病菌時，按一次檢出結果為準，不再復試。

  供試液制備及實驗環境要求同“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則 1105）”。

  如果供試品具有抗菌活性，應盡可能去除或中和。供試品檢查時，若使用了中和劑或滅活劑，應確認有效性及對微生物無毒性。

  供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。

培養基適用性檢查和檢查方法適用性試驗

  本檢查中所使用的培養基應進行適用性檢查。

  檢查方法應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產品的檢查。

  若檢驗程序或供試品發生變化可能影響檢驗結果時，檢查方法應重新進行適用性試驗。

  菌種及菌液制備

  菌種

  試驗用菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。

  洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）〔CMCC（B）23 005〕

  新洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cenocepacia）〔CMCC（B）23 006〕

  神秘伯克霍爾德菌（Burkholderia aenigmatica）〔CMCC（B）23 010〕

  銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10 104〕

  金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B）26 003〕

  菌液制備

  將洋蔥伯克霍爾德菌、新洋蔥伯克霍爾德菌、神秘伯克霍爾德菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養基中或胰酪大豆胨瓊脂培養基上，30~35℃培養 18~24 小時，將培養物用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在 2~8℃，可在24小時內使用。

  陰性對照

  確認試驗條件是否符合要求，應進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。如陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。

  培養基適用性檢查

  本檢查用的商品化的預制培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應進行培養基的適用性檢查。

  檢查用培養基的適用性檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示特性的檢查，檢查項目及所用菌株見表1。

表 1 培養基的促生長能力、抑制能力和指示特性

  培養基促生長能力檢查

  用涂布法分別接種不大于100cfu的試驗菌（表1）于被檢培養基和對照培養基平板上，在檢查規定的培養溫度及不大于規定的最短培養時間下培養，各菌株在被檢培養基與對照培養基上生長的菌落大小、形態特征均應一致。

  培養基抑制能力檢查

  接種不少于100cfu的試驗菌（表1）于被檢培養基和對照培養基中，在檢查規定的培養溫度及不小于規定的最長培養時間下培養，各試驗菌均應不得生長。

  培養基指示特性檢查

  用涂布法分別接種不大于100cfu的試驗菌（表1）于被檢培養基和對照培養基平板上，在檢查規定的培養溫度及培養時間范圍內培養，各菌株在被檢培養基上生長的菌落大小、形態特征、指示劑反應情況等均應與對照培養基一致。

  檢查方法適用性試驗

  供試液制備

  按下列“供試品檢查”中的規定制備供試液。

  試驗菌

  洋蔥伯克霍爾德菌、新洋蔥伯克霍爾德菌和神秘伯克霍爾德菌。

  適用性試驗

  按照供試品檢查法取規定量供試液及不大于100cfu的試驗菌接入規定的培養基中；采用薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌，過濾后，注入規定的培養基或取出濾膜接入規定的培養基中。按照檢查方法，在規定的溫度和最短時間下培養，應能檢出所加試驗菌相應的反應特征。

  結果判斷

  各試驗菌若在上述試驗中均被檢出，按此供試液制備方法和檢查方法進行供試品檢查；若未檢出任一試驗菌，應消除供試品的抑菌活性［見非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則 1105）中的“抗菌活性的去除與滅活”］，并重新進行方法適用性試驗。

  如果經過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為洋蔥伯克霍爾德菌群不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。在此情況下，生產單位或研制單位應根據原輔料的微生物污染情況、生產工藝及產品特性進行產品的風險評估，以保證檢驗方法的可靠性，從而保證產品質量。

供試品檢查

  供試品的檢查應按經方法適用性試驗確認的方法進行。

  陽性對照試驗

  陽性對照試驗方法同供試品的洋蔥伯克霍爾德菌群檢查，對照菌的加量應不大于100cfu。根據方法適用性試驗結果，選擇1株試驗菌作為陽性對照菌株，陽性對照試驗應檢出相應的試驗菌。

  陰性對照試驗

  以稀釋劑代替供試液照相應檢查法檢查，陰性對照試驗應無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。

  供試液制備和増菌培養

  除另有規定外，取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1:10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養基或適當稀釋（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養基中（如：對制藥用水進行檢驗時，可考慮用稀釋10倍的胰酪大豆胨液體培養基進行増菌培養），混勻，30~35℃培養 48~72 小時。

  選擇和分離培養

  取上述培養物劃線接種至洋蔥伯克霍爾德菌群選擇性瓊脂培養基平板上，30~35°C 培養 48~72 小時。

  結果判斷

  若洋蔥伯克霍爾德菌群選擇性瓊脂培養基上有菌落生長，如表現為表 2 中的生長特征等，應進行分離、純化，并采用適宜的鑒定試驗，確證是否為洋蔥伯克霍爾德菌群；若洋蔥伯克霍爾德菌群選擇性瓊脂培養基上沒有菌落生長，或有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出洋蔥伯克霍爾德菌群。

表 2 洋蔥伯克霍爾德菌群選擇性瓊脂培養基上生長特征

稀釋液

  稀釋液配制后，應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。

  1．pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 照無菌檢查法（通則 1101）制備。

  2．pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.2無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液 照緩沖液（通則 8004）配制后，過濾、分裝，滅菌。

  如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。

  3．0.9%無菌氯化鈉溶液 照非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則 1106）制備。

培養基及其制備方法

  培養基可按以下處方制備，也可使用按該處方生產的符合要求的脫水培養基。配制后，應按驗證過的高壓滅菌程序滅菌。

  1．胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）照無菌檢查法（通則1101）制備。

  2．洋蔥伯克霍爾德菌群選擇性瓊脂培養基

  除瓊脂、慶大霉素、萬古霉素、多粘菌素B外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節 pH 使滅菌后在 25°C 的 pH 值為 6.2±0.2，加入瓊脂，加熱融化后，搖勻，分裝，滅菌。滅菌后，冷至 45~50℃，加入多粘菌素B、慶大霉素、萬古霉素，混勻，傾注平皿。

附表 洋蔥伯克霍爾德菌群種水平成員

注：數據統計截止 2021 年 6 月，將根據分類發展進行更新

  起草單位：中國食品藥品檢定研究院 聯系電話：67095695

  復核單位：天津市藥品檢驗研究院、河北省醫療器械檢驗檢驗研究院、遼寧省藥品檢驗檢測院、上海市食品藥品檢驗研究院、山東省食品藥品檢驗研究院、河南省食品藥品檢驗所、廣東省藥品檢驗所、蘇州市藥品檢驗檢測研究中心、四平市食品藥品檢驗所、淄博市食品藥品檢驗研究

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